本文根據(jù)廣東環(huán)凱微生物科技有限公司儀器廠副廠長駱延平在“中國飲料工業(yè)協(xié)會天然礦泉水分會第十三次會員大會暨技術交流會”上分享的報告整理而成。

水，是生命之源。近幾年來，在政府的高度重視和各生產廠家的共同努力下，包裝飲用水（包括天然礦泉水）的產品質量得到了質的提升，但在市場抽檢中不合格產品還是不時的被檢出，主要涉及微生物、理化指標、污染物*、界限指標等方面，其中因為微生物因素被檢出不合格的占70%以上。本文結合xin的食品安全國家標準GB 8537-2018和GB 19304-2018，分析飲用天然礦泉水微生物安全監(jiān)控要點和技術，并分享xin的快速檢測技術。

1

飲用天然礦泉水

微生物安全的主要風險

根據(jù)有關部門統(tǒng)計，2014年至2018年，國家及省級食藥監(jiān)局共檢出2350批次不合格的桶裝水，其中，銅綠假單胞菌被檢出高達1551次，占比60.8%，成為桶裝水突出的質量安全問題。2017一2018年國省抽監(jiān)督礦泉水抽檢的情況（廣東省），飲用天然礦泉水不合格率也達3.6%。這是由于桶裝水企業(yè)中中小型企業(yè)較多，回收桶存在較多的微生物安全問題，所以桶裝水生產企業(yè)抽檢不合格率較高，從而導致的抽檢不合格率較高。

國家標準規(guī)定，飲用天然礦泉水中不得添加任何防腐保鮮物質，使得其生產過程中的微生物污染控制要求更高；桶裝礦泉水回收桶存在大量微生物，造成清洗消毒比較困難；礦泉水藻類污染相當普遍，這些都是礦泉水生產微生物安全的風險所在，而這些風險又存在于生產過程的所有環(huán)節(jié)。

微生物風險主要環(huán)節(jié)

2

飲用天然礦泉水

微生物安全監(jiān)控要點

從2019年6月21日起，礦泉水生產企業(yè)實施更嚴格的飲用天然礦泉水國家標準：GB 19304-2018 《食品安全國家標準 包裝飲用水生產衛(wèi)生規(guī)范》和GB 8537-2018《食品安全國家標準 飲用天然礦泉水》 

● 新舊版標準在微生物要求方面的變化

在生產規(guī)范方面，增加了“包裝飲用水加工過程的微生物監(jiān)控程序指南”，為礦泉水生產企業(yè)生產過程微生物監(jiān)控提供了更具體的指引，但也并未給出具體的參考*，需要企業(yè)根據(jù)實際情況進行制定。

在產品標準方面，修改了大腸菌群、糞鏈球菌、銅綠假單胞菌和產氣莢膜梭菌的*和采樣方案，要求5份樣品不得檢出。

● 飲用天然礦泉水微生物安全監(jiān)控要點

飲用天然礦泉水微生物安全監(jiān)控是一個整體，貫穿于從水源到生產過程到包裝的全流程。

1、水源的保護和微生物監(jiān)控是基礎

曾有調查顯示，檢測福建省77個生產廠家已投入灌裝生產的80處飲用天然礦泉水水源，結果 80個檢樣中18件水樣檢出銅綠假單胞菌，陽性率22.50％，其檢出率與水源的菌落總數(shù)和大腸菌群無顯著相關性。廣東省微生物研究所也曾對南方地區(qū)16家礦泉水生產企業(yè)的45份水源水進行檢測。結果顯示45份水源水中有11份樣品檢出銅綠假單胞菌,陽性率為24.44%。所以，自認為礦泉水水源深處地下，對水源的保護和微生物監(jiān)控不予重視，寄希望于生產過程的后續(xù)殺菌，只會提高生產過程微生物消殺和監(jiān)控的難度，增加成品微生物超標的風險。

2、 設備、管道、容器的微生物監(jiān)控

采水設備、生產設備、管道、儲水容器、包裝容器等與產品直接接觸的接觸面在每次清洗消毒后都需要進行微生物監(jiān)控，以確保不會對產品產生二次污染，接觸面的微生物*可參照成品微生物*的指標，重點是要關注生物膜的形成對接觸面微生物消殺和監(jiān)控的影響。生物膜是一種附著于組織表面、由其自身產生的細胞外多聚基質包裹的有結構的菌細胞群體，由胞外基質及被黏連的菌細胞構成。根據(jù)我們的研究，銅綠假單胞菌容易形成生物膜，對外界不利環(huán)境有強烈的抵抗作用，對各種消毒劑不敏感，通透性差，因此形成生物被波的微生物不易被*清除。設備、管道、容器等不與產品接觸的非接觸面可根據(jù)所處環(huán)境潔凈等級要求進行微生物的監(jiān)控，設備和管道的非接觸面的微生物監(jiān)控可歸類到生產環(huán)境微生物監(jiān)控中。

3、 生產環(huán)境的微生物監(jiān)控

生產環(huán)境的微生物監(jiān)控包含空氣（空間）微生物、人員表面微生物、設備和管道外表面微生物等的微生物監(jiān)控。在xin國家標準GB 19304-2018中，只對灌裝防護區(qū)有具體的潔凈要求，具體的*我們可以參考GB 50687-2011 食品工業(yè)潔凈用房建筑技術規(guī)范中表4.2.2。

4、 生產過程的微生物監(jiān)控

生產過程中微生物監(jiān)控按GB 19304-2018 食品安全國家標準 包裝飲用水生產衛(wèi)生規(guī)范中的附錄A表A.1參照執(zhí)行。

3

飲用天然礦泉水

微生物監(jiān)控技術

● 監(jiān)控的頻率

水源水：每年豐水期、枯水期各一次，特殊情況增加監(jiān)測次數(shù)；

設備、管道、容器：每次清洗消毒后；

生產環(huán)境：每次消毒后；

過程水：每周、每兩周或每月一次（根據(jù)實際情況）；

成品水：每批次。

● 微生物監(jiān)控方法

1、水源水、過程水及成品水：依據(jù)GB 8538-2016 食品安全國家標準 飲用天然礦泉水檢驗方法，采用濾膜法進行檢測。濾膜法微生物檢測基本配置：1、不銹鋼多聯(lián)過濾系統(tǒng)；2、無菌濾膜；3、濾膜夾子；4、配套培養(yǎng)基；5、其它實驗室常規(guī)微生物檢測設備及耗材。

2、設備、人員、容器等表面微生物監(jiān)控：可參考標準有：2015版中國藥典；GB 15979-2002 一次性使用衛(wèi)生用品衛(wèi)生標準；GB 14934-2016 食品安全國家標準 消毒餐（飲）具；GB 15982-2012 醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準；GB/T 18204.4-2013 公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第4部分：公共用品用具微生物。歸納起來檢測的主要方法有：

2.1表面沖洗法：適用于監(jiān)測大面積區(qū)域內表面的微生物含菌量，包括設備管道、儲水罐、包裝容器等。

2.2棉簽擦拭法：適用于所有表面微生物采樣，特別適用于不規(guī)則表面。

2.3接觸平皿（接觸碟）法：用于設備、車間、人員、包裝材料等平整表面的微生物采樣。可取代棉簽擦拭法，減少采樣步驟，確保取樣的準確性和安全性，符合新版GMP標準所規(guī)定的采樣要求，在藥企被廣泛使用。

3、空氣微生物監(jiān)控：空氣微生物包括環(huán)境空氣微生物和壓縮空氣（空氣壓縮機、高壓氣瓶等）的微生物。環(huán)境空氣微生物的監(jiān)控又分為沉降菌和浮游菌的的監(jiān)控。

3.1 沉降菌：通過自然沉降原理收集在空氣中的活微生物粒子，通過的培養(yǎng)基，在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數(shù)。根據(jù)xin標準GB 19304-2018 食品安全國家標準 包裝飲用水生產衛(wèi)生規(guī)范中附錄規(guī)定，飲用天然礦泉水生產過程中沉降菌的測定標準是采用GB/T 18204.3-2013 公共場所衛(wèi)生檢驗方法 第3部分：空氣微生物，但飲用天然礦泉水的灌裝防護區(qū)是潔凈區(qū)，與公共場所的微生物含量差別較大，公共場所的沉降菌檢測方法不適用于礦泉水生產的潔凈區(qū)，建議采用GB/T 16294-2010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法進行檢測。

3.2 浮游菌：用浮游微生物采樣器，收集懸游在空氣中的生物性粒子，通過的培養(yǎng)基，在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數(shù)。浮游菌的檢測方法可采用GB/T 16293-2010 醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）浮游菌的測試方法。

3.3 沉降菌和浮游菌的差異：1.沉降菌屬于被動式采樣，浮游菌屬于主動式采樣；2.沉降菌指飄落在地面或物體表面的灰塵中攜帶的微生物；浮游菌指在空氣中漂浮的塵埃所攜帶的微生物；3.浮游菌濃度與沉降菌落數(shù)無線性關系,沉降菌的檢測不能替代浮游菌的檢測，要全面反映潔凈區(qū)內微生物的污染程度,需同時檢測沉降菌和浮游菌兩項指標。

3

一種水源性致病菌快速檢測技術

環(huán)介導恒溫擴增技術，簡稱LAMP技術，是目前分子檢測手段中操作簡單、靈敏度高、特異性很好的檢測方法，具有廣闊的應用前景。

檢測原理：基于遺傳性的DNA或RNA，針對靶基因的6個區(qū)域設計4條引物，雙鏈DNA在65℃左右處于動態(tài)平衡狀態(tài)；利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在靶序列兩端引物結合處循環(huán)不斷產生環(huán)狀單鏈結構，使得引物在等溫條件下引發(fā)新鏈合成，從而使靶基因擴增，擴增后的產物會引起指示劑顏色或熒光吸收值變化，從而判讀結果。

產品應用：目前已有商業(yè)化的礦泉水中銅綠假單胞菌、產氣莢膜梭菌、糞性鏈球菌等檢測的LAMP檢測試劑盒。